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2005年底,454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统--Genome Sequencer 20 System,被《Nature》杂志以里程碑事件报道,开创了边合成边测序的先河。2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统--Genome Sequencer FLX System。2008年10月,454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件,让GS FLX的通量一下子进步了5倍,正确性和读长也进一步提升。

454型测序仪

GS FLX 测序原理

GS FLX系统的测序原理和GS 20一样,也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术;在DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号开释偶联起来 (图 1)。通过检测荧光信号开释的有无和强度,就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也不需要进行电泳;具有分析结果快速、正确、灵敏度高和自动化的特点。

Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时,使用了一种叫做“Pico TiterPlate”(PTP)的平板,它含有160多万个由光纤组成的孔,孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时,放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进进PTP板,每次只进进一个碱基。假如发生碱基配对,就会开释一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下,经过一个合成反应和一个化学发光反应,终极将荧光素氧化成氧化荧光素,同时开释出光信号。此反应开释出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕捉到。有一个碱基和测序模板进行配对,就会捕捉到一分子的光信号;由此逐一对应,就可以正确、快速地确定待测模板的碱基序列。

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